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新一代非甾体抗炎药设计-针对美丽的蝴蝶型蛋白COX2

在2000年世界前十名的药物中,抗炎药物Rofecoxib (Vioxx)和Celecoxib (Celebrex)是两个环氧化酶-2(COX-2)的抑制剂,它们一年的销售额超过40亿美元。炎症是一种常见病、多发病。炎症反应被多种炎症介质所介导,其中花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)的代谢产物前列腺素(PGs)和白三烯(LTs)是其中重要的两个炎症介质。这两个介质分别经环氧化酶和5-脂氧酶的代谢。因此,阻断AA的代谢就能抑制炎症介质PGs和LTs的生成,从而达到治疗或减弱炎症的目的。1991年,COX-2的发现为非甾体抗炎药(NSAID)的研究开辟了一个新的方向。研究表明:COX-1在正常组织中表达,是正常细胞的组成蛋白;COX-2是酶的诱导形式,主要在炎症细胞,NSAID对炎症的有效治疗作用源于其对COX-2的抑制,而不良反应归于对COX-1的抑制。晶体结构研究表明COX-2是一个同源二聚体的糖基化膜蛋白,单体由三个区组成:1)N-端的表皮生长因子结合区;2)膜结合区域;3)C-端的环氧化酶和过氧化酶活性的催化区域。COX-2的活性结合区是一个长的疏水性通道。比较COX-2与其同工酶COX-1的结构可以发现,COX-2的中央通道要比COX-1大17%,这种体积上的差别是由于组成口袋的氨基酸残基的微小差别所造成的。由此导致的结合口袋的大小和微小的化学环境的改变为设计选择性COX-2抑制剂提供了思路。我们对二芳基杂环类和吡咯嗪-5-乙酸类COX-2选择性抑制剂进行分子对接和三维定量构效关系研究,揭示了这两类化合物在活性口袋的与酶的结合方式,得到了很好的构效关系模型,分析其与口袋周围残基的相互作用和对选择性的影响。提出了除523位Val/Ile变化的空间影响,弱氢键是对选择性造成差别的另一原因。另外所得到的三维定量构效关系模型为选择性抑制剂的结构改造和药物设计提供了指导。

 

寻找SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性构象

2003年3月,科学家们发现了导致SARS的元凶SARS冠状病毒(SARS-CoV),并且成功的完成了SARS-CoV基因组的完整测序。生物信息学分析和病毒学研究表明, SARS病毒对感染起重要作用的蛋白质有6种:E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、多聚酶和3CL蛋白水解酶。其中3CL蛋白水解酶与SARS病毒的复制密切相关,加之序列分析表明3CL蛋白酶在已经测定的SARS基因组中是完全保守的,因此3CL蛋白水解酶成为抗SARS病毒药物筛选的理想靶点。这一蛋白的主要功能是水解病毒所表达的两个多聚蛋白质。另外,3CL蛋白酶还可能具有RNA结合功能。其单体结构由三个结构域组成,其中第1、2个结构域紧密堆积成糜胰蛋白酶折叠类型,第3个结构域由5个α螺旋构成,结构域2和3之间由一个长loop区连接。2003年5月13日Science上发表了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的模建结构以及人的冠状病毒(HCoV 229E)和TGEV的晶体结构。研究表明,它们之间有较高的序列同源性,尤其是在活性位点处。对HCoV 229E和TGEV的3CL蛋白酶研究表明,蛋白质在水溶液中以二聚体和单体混合物的状态存在,但是二者谁是活性构象或者谁的活性更高,还有待于进一步的实验证明。另有实验研究表明,长loop区和α螺旋区的缺失会严重影响酶的活性。除此之外,α螺旋区可能还有其它一些功能,但是实验上对α螺旋区的功能尚未有完全清晰的认识。因此研究3CL的活性构象特别是活性位点和α螺旋结构域的作用有助于进一步认识3CL蛋白酶的生物功能。我们以猪传染性胃肠炎病毒3CL蛋白酶的晶体结构(PDB代码1LVO)为模板,利用MODELLER程序进行了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的同源模建,选择能量打分最低的构象进行进一步优化和评价,最终确定了模建的构型。我们对模建的单体分子进行了分子动力学模拟和相关的构象分析,发现loop区等酶的活性部位有较大的构象变化,预示着在酶的反应过程中可能伴随着构象变化。这将对进一步阐明其构象和底物之间底相互作用提供分子水平的信息,同时能够为更合理地设计蛋白酶的抑制剂提供帮助。

 


Titin激酶,肌肉细胞中的力传感器吗?

心肌的舒张和收缩需要传感器将其机械力转换成生物信号。实验上证实Titin蛋白正是这样一类传感器。Titin蛋白即肌肉细胞中的细丝,是一巨大的蛋白质,其分子量高达3000kDa 左右。该蛋白几乎跨越了肌小节(sarcomere)的一半,是目前为止所发现的最长的共价健相连的蛋白质。Titin蛋白包含了大约300个类似于免疫球蛋白和粘连蛋白的重复结构区域和一个催化结构区域即Titin激酶。该蛋白连接肌小节中的肌球蛋白和肌动蛋白。Titin蛋白随着肌肉的收缩和放松而伸展和折叠,最后肌小节重排从而使肌肉具有弹性。

Titin激酶的晶体结构表明其C端尾巴通过自动调节可以结合在其活性位点从而使得该激酶具有非常规的自抑制机理。Titin激酶的激活包含两个步骤:残基Tyr70的磷酸化和与钙离子或钙调蛋白的结合。该激酶的激活机制中最大的特点是需要通过较大的结构重排使得原来深埋在内部的Tyr70在其磷酸化之前或者磷酸化过程暴露于激酶的表面,同时使C端尾巴离开活性位点。而正是在C端附近,Titin激酶感应来自Titin蛋白的舒展或收缩的影响。所以很明显可以假设,来自细丝Titin蛋白的力诱发了Titin激酶巨大的构象变化。换言之,受到某种力的影响而部分舒展的Titin结构区域将机械压力传递给Titin激酶,随后引起激酶巨大的构象变化,而这种构象变化使得Tyr70磷酸化从而减轻Titin激酶的自抑制。

作为原子力显微镜实验的互补方法,力探针动力学模拟可以帮助我们理解肌肉细胞中Titin激酶受到来自Titin蛋白的拉力而激活过程的分子机理和能量特征。在动力学模拟中,在激酶的两端各加一“弹簧”(实际为简谐弹性势)模拟真实情况下激酶所受到的分别来自两端的张力。两端的弹簧以恒定的速度背相而驰,并计算这一过程中的弹簧所受到的拉力。详细分析模拟过程中的结构和能量变化,从而阐明Titin激酶激活过程中的多个步骤、中间体以及一些重要的局部结构变化。同时以上分析得到的结论还可以通过突变来进一步证实。最终的结论是,通过两端弹簧拉升,Tyr170暴露于溶剂表面和起自抑制作用的尾巴部分离开活性位点,但是催化位点和ATP结合位点仍然得以保持。因此模拟结果表明Titin激酶是受到张力而激活,是肌肉细胞中的力传感器。


 

请进, 石杉碱甲先生!

在乙酰胆碱酯酶(AChE)的深处,有一个水解乙酰胆碱的活性部位。乙酰胆碱(Ach)从酶外达到这个部位,需要经过一个长长的、带有卡口的通道,然后才被水解。可是过量的Ach被水解,就会使人得老年痴呆症。于是,科学家们便寻找一些化合物分子(如他克林、多奈哌齐等)可以结合在AChE的通道中,抑止了Ach的水解,从而起到治疗老年痴呆症的作用。一种天然的分子石杉碱甲(Huperzine A),中科院药物所从中药千层塔中发现的这种化合物分子,同样也是结合在AChE通道中的AChE抑制剂。而且,他具有药效持久的特点。这种分子头尖尾大,结构刚性。在通道卡口打开时,他非常容易经过长长的通道,达到底部。然而,当他要退出底部时却非常困难,因为底部强烈的吸引和狭小的空间使得他无法转身。进来容易出去太难,这就是石杉碱甲药效持久的原因。我们的一次拉伸分子动力学模拟(Steered Molecular Dynamics Simulation)从原子和动态水平上生动、详细地说明了这一点。


 




药物发现与设计中心(DDDC),
上海药物研究所(SIMM), 中国科学院(CAS)